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    Title: 本土性大豆根瘤菌之羧甲基纖維素分解酶:其確認,純化,及免疫電子顯微鏡定位
    Other Titles: Characterization, Purification, and Electronmicroscopic Immunolocalization of Carboxymethyl Cellulase in Indigenous Soybean Rhizobia
    Authors: 胡淳怡
    Contributors: 輔英科技大學 保健營養系
    Keywords: 大豆根瘤菌;羧甲基纖維素分解酶;免疫電子顯微鏡定位;原子力顯微鏡;酵素純化;Soybean Rhizobia;Carboxymethyl Cellulase;Electronmicroscopic Immunolocalization;Atomic Force Microscope;Eenzyme Purification
    Date: 2003
    Issue Date: 2010-11-25 10:03:51 (UTC+8)
    Abstract: 豆科植物可藉由和根瘤菌的共生關係將大氣中的氮固定下來以獲得氮源。而羧甲基纖維素分解酶 (CM-cellulase, E.C 3. 2. 1. 4) 可能為根瘤菌與植物進行初期共生固氮作用時,根瘤菌中分解植物細胞壁的關鍵酵素;而聚半乳果膠分解酶(polygalacturonase, E.C 3. 2. 1. 15)則為初期共生機制(early symbiosis)中的另一根瘤菌中的重要酵素。
    本實驗以大豆根瘤菌Sinorhizobium CCRC 15769及USDA 205為材料,確認了羧甲基纖維分解酶(CM-cellulase)及聚半乳果膠分解酶(poly-galacturonase)的存在。以含有myo-inositol之BⅢ培養基培養根瘤菌,收集後對數期生長階段之菌體,在超音波震盪(sonication)打破菌體,硫酸銨沈澱粗蛋白,陰離子交換樹脂層析及電泳溶離後得到Sinorhizobium CCRC 15769中純化之纖維素分解酶,再以BCA法測定細胞中之酵素活性:其比活性為0.053U,純化倍率為36.30,回收率為9.8 %。使用native PAGE之活性染色法來偵測此酵素,發現其具有二種同功酶,再經由膠體層析法估測其分子量約為196kD及30KD;經由SDS-PAGE活性染色可得到四個酵素次單元,分別是94, 67, 37, 及30kD。可推測此酵素為具有二個同功酶,一個具三個次單元(trimer, 94, 67, 37kD),一個則具一個次單元(monomer, 30kD)。
    以原子力顯微鏡進行非液相大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii CCRC15769, USDA205及Bradyrhizobium japonicum USDA110之型態觀察,由其二維及三維結果顯示其外觀結果大略相同,外形成短桿狀,長約1 至1.5 μm,寬約0.7 μm,高約0.4 μm。並於雲母石上發現當其固定超過三小時,細胞會有崩解的情況發生。於Sinorhizobium fredii CCRC15769細胞表面細部可觀察得其具有直徑約40 nm的蛋白質通道。在純化的根瘤菌纖維素分解酶方面,以原子力顯微鏡觀察纖維素分解酶同功酶一(isozyme 1, IS1),可以初步顯示其為直徑約50 nm之球狀蛋白質。
    以大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii CCRC15769之超薄切片進行電子顯微鏡免疫金標定實驗,結果初步顯示菌體上纖維素分解酶之抗原決定基暴露於菌體內外膜中間位置,此直徑約10nm大小之膠體金於菌體內部胞質中或其他位置則較少被偵測到。以其他屬之根瘤菌,如Bradyrhizobium japonicum USAD110進行此方法之免疫標定,無法偵測到膠體金,而於同種根瘤菌Sinorhizobium fredii USDA205則可偵測到與CCRC 15769數目相近之膠體金,顯示此抗體專一性佳,並可清楚得知同樣種類根瘤菌之纖維分解酶抗原決定基具較高之相似性,而不同種類則具低相似性。於S. fredii CCRC15769培養之初對數期進行類黃素之誘導,結果發現添加之五種類黃素中,genistein 造成菌體中之纖維分解酶抗原決定基明顯往細胞兩端聚積,推測此酵素於共生固氮初期可能為一關鍵酵素。
    Relation: 國立臺灣大學 農業化學研究所 博士論文
    Appears in Collections:[保健營養系] 博碩士論文

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